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1. 透明质酸(HA)又称玻尿酸，是一种具有高黏度氨基多糖，也是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶(HAS)，但含有 HA代谢的其它途径，而动物病原体链球菌含有HAS的基因(H基因)。研究者通过基因工程来改变枯草芽孢杆菌代谢通路，以实现枯草芽孢杆菌生产 HA。
1. （1）目的基因的获取和扩增：链球菌破碎后提取 DNA，经酶切割获取H基因。PCR扩增目的基因，需要根据H基因设计合适的引物，是由于 DNA 聚合酶发挥作用时需要引物参与形成作为核苷酸缩合作用的起点；DNA 聚合酶在延伸子链时需要把核苷酸加到端。
3. （2）表达载体的构建：下图为H基因与p质粒示意图，其中H基因以a链为转录模板链。为通过添加诱导剂来控制H基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为了使下图中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接，p质粒位点1和2所对应的酶分别是。酶切后加入酶催化重组质粒形成。
5. （3）表达载体的导入与筛选：将构建好的重组质粒转入经处理的枯草芽孢杆菌，在含的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。
7. （4）菌种的扩大培养：配制(填“液体”或“固体”)培养基，成分有水、无机盐、蛋白胨和酵母提取物，其中蛋白胨为微生物生长主要提供；调整 pH；灭菌；枯草芽孢杆菌 A 接种到摇瓶培养。
9. （5）大型发酵：进行现代工业发酵时，在发酵罐加入适宜的培养基外，还需严格控制等发酵条件。经扩大培养的枯草芽孢杆菌A 接种定时间后添加，诱导合成HA。HA 对枯草芽孢杆菌来说属于(填“初生代谢产物”或“次生代谢产物”)。
11. （6）产品输出：发酵液中大部分为水，发酵产物浓度较低；发酵液中悬浮固形物主要是菌体和蛋白质的胶状物，故最后对发酵产物进行，获得所需产品。
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1. (2023高三上·长沙期末) 拟南芥体内的基因X具有多个启动子，通过一种光敏色素作为受体，对光刺激进行应答，由此选择不同的启动子并转录出长度不同的mRNA，从而表达出存在于细胞内不同位置的不同蛋白质，由此使拟南芥呈现出不同的生长状态。其相关蛋白的合成过程如下图所示。
1. （1）两种蛋白质( 填“a”或 “b”) 末端的氨基酸序列相同，该末端对应的是蛋白质的(填“ -NH₂ ” 或“-COOH”)末端。a末端是引导蛋白质被运输进入叶绿体的信号肽段。
3. （2）研究人员通过特定技术，将绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因片段插入到基因X的特定位置，使表达出的蛋白质X①、X②能带有绿色荧光蛋白，以实现它们在细胞内的可视化，由此得到A系植株 (GFP基因不含启动子和终止子)。
  ① 根据图1，GFP基因片段应插入到基因X内字母表示的特定位置。
  ②GFP基因来自于水母等动物的细胞中，需先选择合适的限制酶将其从染色体DNA上切割下来。GFP基因两侧的碱基序列如图2所示，根据碱基序列应选择下表中的进行切割。
  限制酶
  识别序列
  BamHI
  G↓GATCC
  CCTAG↑G
  HindIII
  A↓AGCTT
  TTCGA↑A
  Notl
  G↓CGGCCGC CGCCGGC↑G
  EcoRI
  G↓AATTC
  CTTAA↑G
  ③酶切前需对GFP基因进行PCR扩增，b侧所用引物已经确定， a侧引物需在以下4种中进行选择。根据a侧序列应选择不选其他3种的理由是。在PCR仪中完成4个循环后，含有该引物的DNA片段数为个。
  引物1：5'ATCCTGCTA3’
  引物2：5'TATGGATCC3’
  引物3：5GGATCCATA3’
  引物4：5GGAAGGATA3’
5. （3）研究人员在A系植株的基础上，去除产生光敏色素的基因后得到B系植株。随后，分别在黑暗条件和红光条件下培养A 、B两系植株，培养条件及观测到荧光的部位如下表所示。
  表1 GFP荧光的局部部位
  发育条件
  黑暗条件
  红光条件
  A系植物
  细胞质基质
  叶绿体
  B系植物
  细胞质基质
  细胞质基质
  根据以上研究结果， A系植株对红光刺激作出应答被激活的原因是
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1. (2023高三上·茂名月考) C基因编码具有高度特异性杀虫活性的C蛋白，V基因编码的V蛋白是结构和作用机理不同于 C蛋白的杀虫蛋白。利用C-V融合基因和载体(如图)，获得具有高抗虫性的转基因玉米。回答下列问题：
1. （1）作为基因工程的载体需要具备的条件有(答两点)。将C-V融合基因插入到T-DNA中，插入不会破坏 T-DNA的作用，T-DNA的作用是。
3. （2）一般用相同的限制酶分别切割含C-V融合基因的DNA片段和载体，目的是，然后将切割后的片段拼接起来，需使用酶处理。载体中卡那霉素抗性基因作为，可将含目的基因的受体细胞筛选出来。
5. （3）从个体水平对转基因玉米进行检测与鉴定，具体方法是。与导入一种抗虫基因相比，此玉米的优点是。
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1. (2023高三上·青浦期末) 异丁醇是一种新型能源。科研人员研究了酿酒酵母的异丁醇合成途径（如图9），尝试对其进行改造，以期实现大规模生产（如图10）。其中，质粒pUC18可实现目的基因在真核、原核细胞中过表达。
注：Amp^r为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，对真核生物生长无影响
his为组氨酸合成酶基因，组氨酸是微生物生长所必需
限制性内切核酸酶识别序列及切割位点：
BamHI：5’-G↓GATCC-3’ XhoI：5’-C↓TCGAG-3’ Sau3AI：5’-↓GATC-3’ SacI：5’-GAGCT↓C-3’
1. （1）为实现异丁醇大规模生产，可选取的目的基因是（）。（多选）
3. （2）若选用XhoI和Sau3AI对质粒pUC18进行切割，为实现其与目的基因的连接，可在目的基因两端添加。（编号选填）
  ①XhoI和Sau3AI的识别序列 ②XhoI和BamHI的识别序列
  ③SacI和Sau3AI的识别序列 ④SacI和BamHI的识别序列
5. （3）下列关于培养基I~ III的叙述正确的是（）。（单选）
7. （4）启动子的表达具有物种特异性，为了大量获得重组质粒并高效筛选异丁醇生产菌种，图10中的大肠杆菌和酿酒酵母需具备的特点是（）。（多选）。
9. （5）线性化后的重组质粒可随机整合到酿酒酵母的染色体DNA中并稳定表达。经上述流程获得的异丁醇生产菌种在适宜条件下培养，异丁醇产量较野生型酿酒酵母减少，试分析此类菌种异丁醇产量减少的原因。。
11. （6）为初步筛选异丁醇高产菌种，科研人员构建了相关载体，并导入异丁醇生产菌种，载体的部分序列及筛选原理如图11。
  
  图11
  已知BmoR基因的编码链序列为5’-GTGTTAATAT······GATTCATGAA-3’，若将其编码的亮氨酸替换为天冬氨酸，可提高BmoR蛋白与异丁醇的结合能力。现利用PCR技术定点突变改造BmoR蛋白，需设计的引物的序列是。（编号选填）（密码子：亮氨酸5’-UUA-3’，天冬氨酸5’-GAC-3’）
  ①5’- ATATGTCCAC -3’ ②5’-GTGGACATAT -3’
  ③5’- GATTCATGAA -3’ ④5’-TTCATGAATC -3’
13. （7）结合图11及所学知识，分析利用上述载体筛选异丁醇高产菌种的原理。
15. （8）发酵罐是发酵工程中常用的生物反应器，其主要作用是（）。（单选）
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1. (2023高二下·桂林期末) 干扰素是动物和人体细胞受到病毒感染后产生的一种糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖及抗肿瘤作用。利用基因工程技术培育能生产干扰素的植物细胞流程如图所示。请回答下列问题：
限制酶
识别序列和切割位点
EcoR
GATTC
BacHI
GATCC
Sma I
COcCGG
Apa I
GGGCCC
1. （1）分析上图，可选择限制酶来切割质粒，其目的是。质粒被切割后，
  可用酶将其与目的基因连接。
3. （2）图中的重组质粒，除目的基因、标记基因外，还必须有。
5. （3）诱导产生胡萝卜愈仿组织的过程称为。③过程所使用的固体培养基，除了无机盐有机营养物质琼脂、植物激素外，还需添加卡那霉素。卡那霉素的作用是。在分子水平上通常采用技术检测干扰素基因是否导入受体细胞。培养产生干扰素的胡萝卜细胞的技术是。
7. （4）干扰素在体外保存相当困难，但如果将其分子中个别氨基酸进行替换，可延长其在体外的保存期。改造思路是从预期出发，其直接操作对象是，此项技术属于（选填“基因”“蛋白质”）工程。
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1. (2023高二下·忻州期末) 同源重组指发生在同源DNA分子的同源序列（即碱基序列相同或相近）之间的一种重组形式。某实验小组利用同源重组的方法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入真核表达载体的过程如图所示，其中A～D表示操作流程。回答下列问题：
1. （1）载体线性化后进行的PCR过程中引物的作用是，与细胞内的DNA复制不同，PCR反应体系中需要加入酶。
3. （2）图中A、B两处PCR过程中要在载体和目的基因的两端添加。重组产物一般会转入感受态细胞，获得感受态细胞时一般先用处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
5. （3）与利用限制酶和DNA连接酶构建重组质粒的常规方法相比，用该方法构建重组质粒的最大优点是。
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1. (2023高二下·忻州期末) 研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草，实验过程如图1、2所示。下列说法错误的是（　　）

A . PCR扩增GmNF-YA19基因的前提是根据已知核苷酸序列合成两种引物
B . 为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ进行切割
C . 终止子为一段DNA序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来
D . 重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选目的细胞

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1. (2023高二下·运城期末) 草甘膦是一种可以杀灭多种植物（包括农作物）的除草剂，杀灭植物的原理是能够破坏植物叶绿体中的EPSPS合成酶。通过转基因的方法，让农作物产生更多的EPSPS酶，就能抵抗草甘膦，从而让农作物不被草甘膦杀死。下列有关叙述错误的是（）

A . 将EPSPS酶基因导入农作物的叶绿体可避免基因污染 B . EPSPS酶基因在杂草和作物中转录形成的mRNA不同 C . 可通过喷洒草甘膦来检验转基因大豆是否培育成功 D . 农作物细胞不需去壁也可将EPSPS酶基因导入其中

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1. (2023高二下·运城期末) “筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述正确的是（）

A . 单克隆抗体制备过程中，第一次筛选出抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 B . 基因工程中通过标记基因筛选出的细胞都含有目的基因 C . 用含青霉素的培养基筛选出酵母菌和霉菌 D . 用选择培养基对微生物进行筛选时，实验组接种微生物，对照组不接种微生物

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1. (2023高二下·吕梁期末) β—丙氨酸不仅是一种医药中间体，还可以作为食品添加剂，改善食物味道，提高产品质量。可运用构建L—天冬氨酸α—脱羧酶大肠杆菌的方式生产该氨基酸，制备工程菌的示意图如下，回答下列问题：
1. （1）构建工程菌主要需要四个步骤：→基因表达载体的构建→→目的基因的检测与鉴定。
3. （2）构建成功的C除含有目的基因外，还应含有（答出三点即可）。该过程分别对质粒和含目的基因的片段进行双酶切，双酶切的优点是。
5. （3）为了确定工程菌中的L—天冬氨酸α—脱羧酶基因是否转录，可用同位素或荧光标记的作探针进行分子杂交检测。
7. （4）若要通过基因工程的方法探究L—天冬氨酸α—脱羧酶基因能否在酵母菌中表达，实验思路是。
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