（1） 在人类胰岛B细胞中，胰岛素基因最初表达的是由 110个氨基酸残基构成的链状胰岛素原前体（下图1，图中aa代表氨基酸）， 肽链由 N端（游离-NH₂端） 的S区引导进入，随后S区被切去。肽链的氨基酸之间通过形成多个氢键等， 从而使得肽链能，形成有一定空间结构的胰岛素原（B-C-A）。

（2） 胰岛素原借助囊泡被转运至高尔基体。当机体接到胰岛素需求指令后，高尔基体内的酶再切除胰岛素原中的C区，C区被切除后胰岛素原的结构进一步改变，最终形成A 区与 B区相连的活性胰岛素。上述S区、C区被酶切除的过程就是（氢键/二硫键/肽键） 水解的过程。胰岛素是蛋白质，三个二硫键正确搭配的意义是。

（3） 活性胰岛素仍然要借助于囊泡， 才能安全高效地分泌到细胞外， 分泌到细胞外的过程依赖于生物膜的，并消耗能量。胰岛素的功能主要指胰岛素促进，从而增加血糖去向， 降低血糖浓度。

（4） 鉴于活性胰岛素仅含 A区和B区， 专家以大肠杆菌为受体，设计的人胰岛素基因工程生产技术路线（AB 表达法） 是： 化学合成目的基因→目的基因分别与质粒连接→构建成pIA1 和pIB1质粒→pIA1和pIB1质粒分别导入大肠杆菌受体→表达人胰岛素的A区和B区→A区与B区混合形成二硫键→活性胰岛素。AB表达法中目的基因的具体名称是。因一些胰岛素蛋白形成了错误的二硫键，而没有生物活性，由此法生产重组人胰岛素效益低、成本高。专家进一步研究认为，在胰岛B细胞内C区可能起到组装A区和B区的“脚手架”作用。为验证此假说，他们采用酶以人胰岛 B 细胞的 mRNA为初始模板合成DNA，再扩增DNA 获得目的基因，然后制备B-C-A多肽链，最后再用酶模拟细胞内的过程将C区切除（图2） 。由此（BCA表达法）生产成本大幅度降低。

（1） 卒中、脑梗、心梗等心脑血管病多是因动脉粥样硬化、血栓引起组织缺血所致。血栓由纤维蛋白构成，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA） 由527个氨基酸构成（如下图）， t-PA 进入血浆后激活纤溶酶原， 使之转化成纤溶酶， 酶将沉积在血管内壁的纤维蛋白分解血栓裂解， 血管畅通。t-PA进入血浆后多与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，很快失去活性，所以溶栓时要持续输入t-PA。然而， 大剂量t-PA易诱发出血。鉴于此， 有人提出通过抑制的活性， 以延长t-PA的活性。进一步研究显示，t-PA第84位的半胱氨酸替换为丝氨酸后的t-PA溶血栓更快， 这种改造的t-PA副作用更小。用生物化学手段直接改造“t-PA”蛋白质的结构，或是定点改造 t-PA 基因成为“突变基因”，通过基因工程等生物工程技术获取“突变的t-PA”。通过后者改造“t-PA”的主要优势是（写出一点）。

（2） 已知t-PA基因碱基序列、丝氨酸密码子，可以通过人工合成目的基因（t-PA 突变基因） 、基因与质粒重组构建表达载体、表达载体进入受体细胞等一系列操作，最终获取“突变的t-PA”。这种基于t-PA的分子结构和功能的关系，通过一系列DNA 分子层面的操作获取人类所需蛋白产品的第二代基因工程过程又叫做。

（3） 从上述人t-PA 基因获得第84位半胱氨酸替换为丝氨酸编码序列的t-PA突变基因，常借助PCR体外定点定向诱变获得。工作原理如图： 先合成包含突变碱基的两个突变引物。因突变点不位于基因端点，要借助 PCR 获得完整的t-PA 突变基因，还要合成两个正常引物1、2.参考图中正常引物1（5'-TACCAAGTGATCTGCAGA-3'）、t-PA 基因和 PCR 诱变过程原理图， 正常引物2 是5’……-3’（写出5’端的6个碱基即可）

（4） 为了与质粒高效连接，t-PA突变基因两端应携带相应的限制酶识别序列。应将限制酶识别序列设计在两条正常引物的端。限制酶能够使 DNA 分子中特定部位的键断开。

（1） 利用外源DNA、质粒制备含CD47基因的重组质粒。如图为含CD47基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，Kan'、Tc'分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。

①为了形成合适的重组质粒，应该选用BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切割外源DNA和质粒DNA，原因是：a、；b、。

②重组质粒导入受体细胞的成功率很低，需经筛选才能获得导入成功的受体细胞。结合图所获得的重组质粒分析，所选受体细胞应具备条件。

（2） 如图是利用上述基因工程获得的CD47蛋白制备相应单克隆抗体及相关治疗效果检测实验过程。

①图中获得细胞A的器官通常是。

②图中过程b可以采用的方法有。（答出一点）

③图中“筛选”一般需要进行两次，目的依次是：第一次，第二次。

④如图中共同培养吞噬细胞和肿瘤细胞，在实验组加入不同浓度的CD47抗体，测定吞噬细胞的吞噬指数（吞噬指数与吞噬细胞所吞噬的肿瘤细胞数量成正相关），实验结果如图所示。该实验结果对临床治疗肿瘤有何指导意义？。

（1） 利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因需要酶。

（2） 基因工程中的核心工作是，该过程需要的工具酶是。

（3） 如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。

在设计PCR引物时最好添加限制酶的识别序列，选择依据是。

经GenBank检索后，得知胰岛素基因左端①处的碱基序列为—GCATTCTGAGGC—，则其中一种引物设计的序列是5'—3'。

（1） 干扰素属于免疫活性物质，免疫活性物质是指。

（2） 利用基因工程将干扰素基因导入大肠杆菌，可获得产生干扰素的工程菌。基因表达载体构建是基因工程的重要一环。质粒是一种常用于基因表达载体构建的运载体，构建重组质粒需要的工具酶有，重组质粒中标记基因的作用是。

（3） 科学家通过发酵工程大量培养具有干扰素生产能力的大肠杆菌细胞，从而生产大量的干扰素，在发酵过程中，除需观测发酵条件外，还要随时检测培养液中的、等，以了解发酵进程。

（4） 干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子中的第十七位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸，则在—70℃的条件下，干扰素可以保存半年。请你据此事实，阐述利用蛋白质工程技术获得上述耐保存的干扰素的基本思路：。

（1） 利用PCR技术可以扩增35s启动子，PCR技术的原理是，此技术设计引物很关键，引物是。利用此技术扩增的35s启动子可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用来鉴定PCR的产物。

（2） 根据限制酶识别位点，为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择限制酶切割图甲的DNA片段。

（3） 为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是、，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是（填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能。

平板类型	①	②	③
甲：无抗生素	+	+	+
乙：卡那霉素	-	-	+
丙：？	-	+	+
丁：？	-	-	+