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1. (2024高三下·内江月考) 为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。回答下列问题：
1. （1）为获取大量除草剂抗性基因G的拷贝，一般采用技术进行扩增，扩增时，冷却至55～60℃的目的是。在用除草剂抗性基因G与Ti质粒构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有。
3. （2）将含除草剂抗性基因G的重组Ti质粒转入农杆菌，为提高基因表达载体进入农杆菌的效率，需要用Ca²⁺处理细胞，其目的是。在“筛选1”中含氨苄青霉素的培养基能将成功导入表达载体的农杆菌筛选出来，而含无色物质K的培养基却不能，原因是。
5. （3）利用进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株。从步骤①到步骤②需要更换新的培养基，原因是。
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1. (2024高三下·湖南月考) 在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，被广泛应用于奶酪和酸奶的生产。科学家将编码牛凝乳酶的基因(长度1.5kb)导入大肠杆菌获得工程菌，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
1. （1）提取小牛胃黏膜组织中的mRNA，经逆转录得到cDNA，选择合适的引物进行PCR扩增，PCR引物碱基数一般在20～30个之间，过短则导致。
3. （2）如表为操作过程中可能用到的限制酶，图1为获得的目的基因及末端(除黏性末端序列外，其他碱基序列省略)，图2为要使用的质粒，其中的Tet'、Amp'分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。对质粒进行切割时，选用的两种限制酶为。目的基因和质粒能连接成重组质粒的原因是，导入的目的基因在变体细胞中能成功表达的理论基础是。
  限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
  识别位点及切割位点 -G↓GATCC- -T↓GATCG- -CCC↓GGG- -↓GATC-
5. （3）将转化后的大肠杆菌接种在含的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图，号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
  注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中
7. （4）已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序：(用箭头表示)
  ①重组DNA分子导入大肠杆菌
  ②随机改变凝乳酶基因的序列
  ③分析突变蛋白功能，设计结构
  ④改变凝乳酶基因的特定序列
  ⑤培养细胞后提纯突变蛋白
  ⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组
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1. (2024高三上·湖南期末) 为了获得抗蚜虫转基因棉花植株，研究人员分别从雪花莲和尾穗苋两种植物中提取了凝集素基因GNA和ACA，经PCR扩增(如图甲所示)，连接成GNA-ACA融合基因，再与质粒(pBI121)构建成重组载体(如图乙所示)，再经一系列操作将融合基因导入棉花细胞。回答下列问题：
1. （1）甲图中，A过程调节至95℃，目的是通过高温破坏，使双链DNA解聚为单链；B过程中需要两种引物，引物是。配制PCR反应体系时需在冰上预冷，等程序设置完毕后再放入PCR仪中，预冷的目的是。
3. （2）分析图乙可知，使用限制酶和DNA连接酶处理GNA基因和ACA基因，可获得GNA-ACA融合基因。将GNA-ACA融合基因导入质粒时应选用限制酶，目的是。
5. （3）利用含重组载体的农杆菌感染棉花细胞的方法称为。为筛选出转基因细胞，可将感染农杆菌的棉花细胞接种在含的培养基上，选取能在培养基上生长的棉花细胞，经植物组织培养可获得抗蚜虫转基因棉花植株。
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1. (2024高三上·雁峰期末) 天山雪莲 SikCDPK1基因（简称S基因）可提高转基因烟草的抗低温能力。在基因工程中常用35S启动子（通常条件下具有持续转录活性）来驱动S基因表达，但有时会使转基因植物发育不良。为探究RD29A（一种低温诱导型启动子）调控S基因表达对转基因烟草的生长发育和抗低温能力的影响，科研人员开展了相关研究。回答下列问题：
1. （1）启动子是识别和结合的部位。与35S启动子相比，RD29A启动子对植物正常生长发育影响较小，从其调控基因表达特点的角度推测原因是。
3. （2）为了发挥 RD29A 的优势，科研人员将实验室已有的质粒甲中的 35S 替换为 RD29A（如图所示）。
  将质粒甲、乙分别导入两组农杆菌细胞，用添加的培养基进行筛选，然后将烟草叶片细胞与农杆菌共同培养，再筛选转化细胞，经技术培育成幼苗。将目的基因导入植物细胞除了农杆菌转化法，还有我国独创的法。
5. （3）取长势相同的上述两种转基因烟草（甲、乙）和非转基因烟草（WT），在 44℃条件下处理 48h ，然后测定各组烟草的叶绿素含量和 MDA 含量，结果如下图：
  据图分析推测三组烟草的生长状况及抗低温能力。依据是。
  实验结论：在低温条件下，RD29A 启动子能（填“激活”或“抑制” ）S 基因的表达，且比 35S 启动子调控作用更优。
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1. (2024高二下·南海月考) B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。
注：启动子是指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光
下列关于该实验的叙述，不正确的是（）

A . B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录 B . 可从水稻体细胞和精子中提取RNA构建的cDNA文库中获得B基因中编码蛋白的序列 C . 过程②在培养基中加入卡那霉素以检测T-DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上 D . 鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光

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1. (2024高二下·南海月考) 除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制EPSP合成酶的作用，从而使植物多种代谢途径受影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性，除掉杂草的同时作物也会受损。培育抗草甘膦作物是解决办法之一，下列关于转入外源EPSP合成酶基因使矮牵牛抗草甘膦流程的叙述正确的是（　　）

A . 可以通过mRNA在逆转录酶的作用下构建cDNA文库，从中获取EPSP合成酶基因 B . 用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒，仅涉及磷酸二酯键的断裂和形成 C . 基因表达载体组件中的起始密码子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 D . 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，农杆菌的转化能使植物细胞都能培育出转基因植株

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1. (2024高三上·湖北期末) ga3ox能催化合成有活性的赤霉素，而ga2ox则能钝化有活性的赤霉素。MD为野生型矮牵牛品种，712-15和712-26是转入了ga3ox基因和ga2ox基因中的同一种基因的矮牵牛品种，但在基因组中插入的位置不同。在相同环境下种植，三个品种的株高有明显差异，表现为MD>712-15>712-26．

（1） ga3ox的作用机理是，赤霉素通过来增加植株高度。
（2） 712-15品种和712-26品种都是转入了（填“ga3ox”或“ga2ox”）基因，但两者的株高却有显著差异，表明。

（3）有人猜测，株高的调控是通过蛋白P41与蛋白P42或蛋白P45结合实现的，科研人员依据以下原理研究蛋白P41与蛋白P42、蛋白P45之间的关系：在酵母菌细胞中，可以利用基因工程表达出两种融合蛋白（BD—待测蛋白X、AD—待测蛋白Y），若两种待测蛋白可以相互作用，则AD蛋白和BD蛋白就能充分接近形成复合物，并启动组氨酸合成基因的转录（如图1），否则组氨酸合成基因不能转录（如图2）。

由此，科研人员做了如下实验。

第一步：构建以下5组重组载体，

	重组载体包含的部分基因
载体1	AD蛋白基因色氨酸合成基因
载体2	BD蛋白基因亮氨酸合成基因
载体3	AD蛋白基因蛋白P41基因色氨酸合成基因
载体4	①基因蛋白P42基因亮氨酸合成基因
载体5	BD蛋白基因 ②基因亮组氨酸合成基因

上表空格相应的基因分别为①；②。

第二步：将载体1和载体2、载体1和载体4、载体1和载体5、载体2和载体3、载体3和载体4、载体3和载体5分别导入六组不能合成色氨酸、亮氨酸和组氨酸的酵母菌。

第三步：将上述六组酵母菌依次涂布至不含色氨酸、亮氨酸的培养基a~f中，均能长出菌落，原因是。

第四步：再将a~f培养基上的菌落对应拓印（原位接种）至不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸培养基A~F中，结果只有F中长出菌落，则本实验的结论是。

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1. (2024高三上·扬州期末) 人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题：
注1：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔
注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达
1. （1）图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是。
3. （2）当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。同源切割是一种代替将目的基因导入基因表达载体的方法。
5. （3）阶段Ⅱ将环化质粒导入用处理的大肠杆菌，然后在含有的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。
7. （4）为了检验重组质粒是否构建成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物进行PCR扩增，则最好选择图2中的引物。PCR反应体系中需加入模板、、、引物、Mg²⁺、缓冲液等，再将扩增产物进行来确定可用于导入酵母菌的重组质粒。
9. （5）阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分（a．氨苄青霉素b．组氨酸c．无机盐d．琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。
11. （6）从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是。
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1. (2024高三下·成都开学考) 有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，饮用牛奶后易出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，使获得的转基因奶牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。根据如下操作流程回答相关问题：
1. （1）通过图中②过程采集的B奶牛精子不能直接使成熟的卵细胞受精，常要用化学诱导法对奶牛的精子进行处理，即用一定浓度的处理。
3. （2）为了获得更多的卵母细胞，在进行①过程前，需要用处理奶牛A，从输卵管中采集卵母细胞后，还需要体外培养至期，才可以进行③过程；③过程表示的胚胎工程技术为。
5. （3） ④过程表示基因表达载体的建构过程，概述其操作流程。
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1. (2024·高三上期末·潮州) 成纤维细胞生长因子21（FGF21）是一种调节机体代谢的分泌型蛋白，具有降低血糖、提高胰岛素敏感性等生理活性。但由于FGF21稳定性差，导致FGF21药效较差。科研人员以含有FGF21基因（F）的重组质粒pSUMO-FGF21（p-F）为模板，对F进行定点突变，构建含突变基因的突变质粒PSUMO-mmtFGF21（p-mF），从而实现对FGF21的改造，部分过程如图1所示。据图回答下列问题：
1. （1）研究发现、改变FGF21中的氨基酸序列，可提高FGF21的稳定性。这首先需要在数据库中检索FGF21的氨基酸序列和，据此设计突变位点并对蛋白质结构进行模拟验证。
3. （2）通过PCR技术可实现对FGF21基因（F）进行定点突变。
  ①将引物、p-F（DNA模版）、缓冲液、无菌水、4种脱氧核苷酸和等加入微量离心管中，构成PCR体系进行反应。
  ②用于定点突变的引物长度不能过短，否则会由于，导致定点突变失败。
  ③应选择图2中的哪对引物进行定点突变。
  A.1和4
  B.2和3
  C.1和3
  D.2和4
5. （3）在转化大肠杆菌时，用低温和溶液处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态细胞，有利于突变质粒进入大肠杆菌中。培养一段时间后，取适量菌液涂布在含有平板上筛选出含p-mF的细胞（菌落）。
7. （4）已筛选出含mF的大肠杆菌繁殖的后代中出现不含有mF的菌体，为了解决这一问题，最佳的方案是。
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