（1） 构建基因表达载体时，用限制酶EcoRV和PstⅠ切割质粒pUC18和含E蛋白基因的DNA片段后，选用（选“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”）进行连接。将重组质粒pUC20导入大肠杆菌前，先用Ca²⁺处理大肠杆菌，目的是。

（2） 原核生物编码蛋白质时偏好使用GTG编码起始密码子，而真核生物偏好使用ATG。为驱动受体大肠杆菌E蛋白基因的高效表达，对E蛋白基因模板链3^'端的引物进行的改造，并优化E蛋白基因上游的序列以驱动转录。

（3） 初步获得的细菌含有质粒pUC18或质粒pUC20。为筛选出含有重组质粒的大肠杆菌，配制A~C三种选择培养基进行初筛，结果如表所示：

培养基	抗生素种类	菌落类型
A	四环素	甲
B	氨苄青霉素	乙
C	四环素+氨苄青霉素	丙

根据初筛结果，为获得目的菌，需从菌落类型中挑选多个单菌落分别接种到选择培养基进一步筛选。实验的思路和预期结果及结论：。

（1） 从人结肠癌组织中提取总RNA，经过程合成cDNA.根据人EGFR前体cDNA的序列设计合成引物，扩增得到DNEGFRcDNA，其表达产物因缺失胞内区而没有信号转导功能，但其能够与竞争结合某些对应物质，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

（2） PCR过程所用引物如下，据上图可知，构建重组质粒时使用的两种限制酶是。研究人员将DNEGFR和EGFP融合在一起的目的是。

5'-AAAAGCTAGCACCATGCGACCCTCCGGGAC-3'

5'-TAATCCGCGGTACGTACCGCATGAAGAGGCCGATCCC-3'

（3） 向感受态细菌悬浮液中加入重组质粒混匀。扩大培养后取菌液涂布于含有的固体培养基平板上，37℃正向放置0.5h，然后倒置平皿37℃培养12~16h.挑选菌落分别扩增、鉴定，待鉴定正确后大量提取质粒。

（4） 将重组质粒pEGFP-N1-DNEGFR包裹到主要由构成的脂质体内，与动物细胞发生融合，重组质粒最终发生转化。72h后再利用光谱激光扫描共聚焦显微镜观测结果见图A，检测表明融合蛋白成功锚定于。为了让结果更加严谨，设置B、C两组对照，推测B组的处理方式是

（1） 在人类胰岛B细胞中，胰岛素基因最初表达的是由 110个氨基酸残基构成的链状胰岛素原前体（下图1，图中aa代表氨基酸）， 肽链由 N端（游离-NH₂端） 的S区引导进入，随后S区被切去。肽链的氨基酸之间通过形成多个氢键等， 从而使得肽链能，形成有一定空间结构的胰岛素原（B-C-A）。

（2） 胰岛素原借助囊泡被转运至高尔基体。当机体接到胰岛素需求指令后，高尔基体内的酶再切除胰岛素原中的C区，C区被切除后胰岛素原的结构进一步改变，最终形成A 区与 B区相连的活性胰岛素。上述S区、C区被酶切除的过程就是（氢键/二硫键/肽键） 水解的过程。胰岛素是蛋白质，三个二硫键正确搭配的意义是。

（3） 活性胰岛素仍然要借助于囊泡， 才能安全高效地分泌到细胞外， 分泌到细胞外的过程依赖于生物膜的，并消耗能量。胰岛素的功能主要指胰岛素促进，从而增加血糖去向， 降低血糖浓度。

（4） 鉴于活性胰岛素仅含 A区和B区， 专家以大肠杆菌为受体，设计的人胰岛素基因工程生产技术路线（AB 表达法） 是： 化学合成目的基因→目的基因分别与质粒连接→构建成pIA1 和pIB1质粒→pIA1和pIB1质粒分别导入大肠杆菌受体→表达人胰岛素的A区和B区→A区与B区混合形成二硫键→活性胰岛素。AB表达法中目的基因的具体名称是。因一些胰岛素蛋白形成了错误的二硫键，而没有生物活性，由此法生产重组人胰岛素效益低、成本高。专家进一步研究认为，在胰岛B细胞内C区可能起到组装A区和B区的“脚手架”作用。为验证此假说，他们采用酶以人胰岛 B 细胞的 mRNA为初始模板合成DNA，再扩增DNA 获得目的基因，然后制备B-C-A多肽链，最后再用酶模拟细胞内的过程将C区切除（图2） 。由此（BCA表达法）生产成本大幅度降低。

（1） 卒中、脑梗、心梗等心脑血管病多是因动脉粥样硬化、血栓引起组织缺血所致。血栓由纤维蛋白构成，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA） 由527个氨基酸构成（如下图）， t-PA 进入血浆后激活纤溶酶原， 使之转化成纤溶酶， 酶将沉积在血管内壁的纤维蛋白分解血栓裂解， 血管畅通。t-PA进入血浆后多与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，很快失去活性，所以溶栓时要持续输入t-PA。然而， 大剂量t-PA易诱发出血。鉴于此， 有人提出通过抑制的活性， 以延长t-PA的活性。进一步研究显示，t-PA第84位的半胱氨酸替换为丝氨酸后的t-PA溶血栓更快， 这种改造的t-PA副作用更小。用生物化学手段直接改造“t-PA”蛋白质的结构，或是定点改造 t-PA 基因成为“突变基因”，通过基因工程等生物工程技术获取“突变的t-PA”。通过后者改造“t-PA”的主要优势是（写出一点）。

（2） 已知t-PA基因碱基序列、丝氨酸密码子，可以通过人工合成目的基因（t-PA 突变基因） 、基因与质粒重组构建表达载体、表达载体进入受体细胞等一系列操作，最终获取“突变的t-PA”。这种基于t-PA的分子结构和功能的关系，通过一系列DNA 分子层面的操作获取人类所需蛋白产品的第二代基因工程过程又叫做。

（3） 从上述人t-PA 基因获得第84位半胱氨酸替换为丝氨酸编码序列的t-PA突变基因，常借助PCR体外定点定向诱变获得。工作原理如图： 先合成包含突变碱基的两个突变引物。因突变点不位于基因端点，要借助 PCR 获得完整的t-PA 突变基因，还要合成两个正常引物1、2.参考图中正常引物1（5'-TACCAAGTGATCTGCAGA-3'）、t-PA 基因和 PCR 诱变过程原理图， 正常引物2 是5’……-3’（写出5’端的6个碱基即可）

（4） 为了与质粒高效连接，t-PA突变基因两端应携带相应的限制酶识别序列。应将限制酶识别序列设计在两条正常引物的端。限制酶能够使 DNA 分子中特定部位的键断开。

（1） 利用外源DNA、质粒制备含CD47基因的重组质粒。如图为含CD47基因的外源DNA、质粒的有关信息，EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，Kan'、Tc'分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。

①为了形成合适的重组质粒，应该选用BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切割外源DNA和质粒DNA，原因是：a、；b、。

②重组质粒导入受体细胞的成功率很低，需经筛选才能获得导入成功的受体细胞。结合图所获得的重组质粒分析，所选受体细胞应具备条件。

（2） 如图是利用上述基因工程获得的CD47蛋白制备相应单克隆抗体及相关治疗效果检测实验过程。

①图中获得细胞A的器官通常是。

②图中过程b可以采用的方法有。（答出一点）

③图中“筛选”一般需要进行两次，目的依次是：第一次，第二次。

④如图中共同培养吞噬细胞和肿瘤细胞，在实验组加入不同浓度的CD47抗体，测定吞噬细胞的吞噬指数（吞噬指数与吞噬细胞所吞噬的肿瘤细胞数量成正相关），实验结果如图所示。该实验结果对临床治疗肿瘤有何指导意义？。

（1） 利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因需要酶。

（2） 基因工程中的核心工作是，该过程需要的工具酶是。

（3） 如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。

在设计PCR引物时最好添加限制酶的识别序列，选择依据是。

经GenBank检索后，得知胰岛素基因左端①处的碱基序列为—GCATTCTGAGGC—，则其中一种引物设计的序列是5'—3'。

（1） 利用PCR技术扩增CM-CSF基因时，需要在引物上添加限制酶的识别序列，同时也便于与质粒正确连接。

（2） 质粒和GM-CSF基因结合形成的重组质粒在受体细胞中能够稳定存在并发挥作用，在CM-CSF基因的首端必须具有，其作用是。

（3） 筛选已导入GM-CSF基因的大肠杆菌时，先将大肠杆菌接种到含有抗生素的培养基中培养，从获得的菌落中取菌体接种到含有抗生素的培养基中，若（填“有菌落生长”或“无菌落生长”），则获得的培养物符合要求。