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1. (2024高三下·衡阳开学考) 猴痘是一种由猴痘病毒感染所致的病毒性人畜共患病，人类感染猴痘病毒出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似。某科研团队欲研究猴痘病毒表面的抗原蛋白S以生产治疗猴痘的抗体，下列叙述错误的是（）

A . 细胞A是从小鼠的脾中分离得到的B淋巴细胞 B . 过程②需要逆转录酶，过程③需要限制酶和DNA连接酶 C . 图中的X基因为S蛋白基因，结构甲上除X基因外还应含有标记基因 D . 利用图示方法获得的抗体不具有生物学活性，不可以直接用于治疗猴痘病毒感染

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1. (2024高三下·衡阳开学考) “中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。该品种以八里庄杨为实验材料，经转mtl-D基因培育获得。如图为培育“中天杨”的操作流程，①~⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。回答下列问题。
注：Ti质粒中的Tet^r为四环素抗性基因，Amp^r为氨节青霉素抗性基因。
限制酶
BclⅠ
EcoRⅠ
XbaⅠ
Sau3AⅠ
BamHⅠ
切割位点
T↓GATCA
G↓AATTC
T↓CTAGA
↓GATC
G↓GATCC
1. （1）与杂交育种相比，基因工程育种的优点有(填序号)。
  ①操作方法简便②目的性强，能定向改造生物性状③育种周期短④不受生殖隔离限制，能克服远缘杂交不亲和障碍⑤安全性高，对生态没有威胁
3. （2）过程①需要的酶是，过程②需要的工具酶是。
5. （3）采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是，若目的基因扩增3代，则共用引物个。PCR完成以后，常采用法来鉴定PCR的产物。
7. （4）培育转基因杨树的核心工作是，在进行该工作时，应在mtl-D基因的两侧添加限制酶的识别序列。
9. （5）将目的基因导入受体细胞除图示方法外，还有。为了确认目的基因在植物细胞中是否成功表达，从分子水平通常使用法进行检测。
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1. (2023高三上·福田月考) 幽门螺杆菌（Hp）属于一类致癌物，Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能合成其特有的Ipp20蛋白质，科研人员据此利用基因工程制备Hp疫苗，该过程所选择的质粒及操作步骤如图所示。回答下列问题：
1. （1）通过PCR扩增Ipp20基因的反应需要在溶液中进行，扩增Ipp20基因时的基本条件包括DNA模板、原料、TaqDNA聚合酶、等。
3. （2）在PCR反应体系中一般需要加入Mg²⁺ ，原因是。科研人员探究了不同浓度的Mg²⁺对PCR扩增效果的影响，结果如表所示。科研人员认为PCR．反应高效进行，Mg²⁺浓度并不是越高越好，据表分析，依据是。
  Mg²⁺浓度/（mmol·L^-1）
  0
  2
  3
  4
  5
  6
  Ipp20基因相对含量
  -
  +
  ++
  +++++
  ++++
  +++
  注：“-”表示未检测到Ipp20基因，“+”表示检测到Ipp20基因，且“+”越多，检测到的含量越多。
5. （3）已知在构建基因表达载体时使用了限制酶XhoI和XbaI切割质粒和Ipp20基因。科研人员采用了影印法筛选含有Ipp20基因的大肠杆菌，即使用无菌的线毡布压在培养基A（添加潮霉素）的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B（添加氯霉素）上。根据图示结果分析，含有Ipp20基因的大肠杆菌应从培养基中获取，理由是。且符合要求的大肠杆菌菌落是。
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1. (2024高三上·汕头期末) 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病，其包膜蛋白中包含6个保守序列Bp蛋白和抗原表位R9蛋白。免疫佐剂热敏肠毒素B单位（LTB）是一种免疫增强剂。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组拟先构建针对该病毒的多表位疫苗基因的重组质粒，操作流程如图1、图2所示。请回答以下问题：
1. （1）图1为利用融合PCR技术获得LTB-R9-Bp融合基因的过程，反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及。引物P2与P3设计时要求除了考虑引物的碱基数量、与模板链的特异性结合之外，还需要。请在下图中标出②过程两条模板链的5’端和3’端。
3. （2）获得LTB-R9-Bp融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物继续进行PCR。利用电泳技术对扩增结果进行检测，发现除目标条带外还有其他非特异性扩增条带，原因可能有。
  A．模板DNA被污染
  B．引物特异性不强
  C．加入原料过多
5. （3）图2构建融合基因表达载体时，质粒上除了复制起点、标记基因和多个限制酶的识别序列外，还需要有。将得到的重组质粒导入低温、低浓度的处理的大肠杆菌，完成转化实验。
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1. (2024高三上·东莞期末) 堪称“基因魔剪”的CRISPR/Cas9基因编辑技术在育种中有重要作用。CRISPR/Cas9系统转录出的具有序列特异性的单向导RNA（sgRNA）能引导Cas9蛋白靶向结合目的基因的特定序列并对其切割，如图A所示。断开双链的目的基因在修复过程中会发生碱基的插入、缺失或替换，从而实现对目的基因的编辑。水稻的OsSWEET11基因（位于11号染色体上）是被白叶枯病菌广泛利用的感病基因。利用CRISPR/Cas9技术可实现对水稻OsSWEET11基因进行“敲除”。图B是利用农杆菌Ti质粒构建的表达载体。
回答下列问题：
1. （1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻OsSWEET11基因进行“敲除”，需要依据的某段序列设计sgRNA，根据sgRNA序列合成双链DNA，可通过测序技术或技术验证该双链DNA的纯度和完整性。
3. （2）实施转基因操作时，需先将图B所示表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染野生型水稻愈伤组织，从而实现对愈伤组织细胞中OsSWEET11基因的“敲除”。此过程中，潮霉素抗性基因的作用是。
5. （3）将转基因操作后的愈伤组织进行培养，获得甲、乙、丙三棵植株，在个体生物学水平上对这三棵植株进行抗白叶枯病菌的鉴定，方法是。结果显示甲植株感病，乙植株不感病，丙植株感病程度介于两者之间，从CRISPR/Cas9基因编辑技术对细胞目的基因“敲除”的数量角度考虑，对丙植株的感病情况作出合理猜测：。
7. （4）利用丙植株为材料，运用遗传学的知识，设计实验验证你上述猜测。请写出实验思路：，若后代不感病植株比例为则支持你的猜测。
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1. (2024高三上·期末) 目前，临床上开始采用重组人血清白蛋白（rHSA）替代人血清白蛋白（HSA）。图1为工业化生产rHSA的过程示意图。回答下列问题：
1. （1）依据图1和下表所示分析，在获取目的基因时，最好选择限制酶和共同切割质粒，双酶切法的优点有（答出2点）。除图示中的启动子之外，构建的表达载体还需要具有的结构有（答出2点）。
  限制酶
  Ⅰ
  Ⅱ
  Ⅲ
  Ⅳ
  识别序列及切割位点
  G↓GATCC
  CCTAG↑G
  T↓GATCA
  ACTAG↑T
  ↓GTAC
  CATG↑
  A↓AGCTT
  TTCGA↑A
3. （2） PCR扩增时，要设计一对引物（引物1和引物2），根据图2中HSA基因的两端序列，需要设计的引物序列分别是和。如PCR过程完成四次循环，则所需引物的总数为。
5. （3）可采用将重组基因表达载体导入酵母菌。然后在含四环素和氨苄青霉素的两种培养基上分别筛选，筛选出具有特点的是含HSA基因表达载体的目标菌。
7. （4） AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，生产中常以其作为HSA基因的启动子，在以为碳源的培养基中进行培养发酵。该方法的优点是。
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1. (2024高三上·海淀期末) 研究人员将 PCR 扩增得到的毒物诱导型启动子S(箭头表示转录方向)插入图中载体P区，构建表达载体，转入大肠杆菌，获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述不正确的是（）

A . PCR 扩增启动子 S 时，图中引物I、Ⅱ分别加入BamH I、XhoI识别序列 B . 用Ca²⁺处理大肠杆菌以便于转入构建好的表达载体 C . 使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入载体的菌株 D . 可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含毒物

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1. (2024高三上·海淀期末) 为提高基因编辑的精准性，减少脱靶，科研人员尝试对基因编辑系统进行改造。
1. （1） CRISPR-Cas9 是被普遍应用的基因编辑系统，由人工设计的sgRNA 靶向目标基因，Cas9 蛋白在sgRNA 引导下切割目标基因的双链DNA，使其断裂，促使细胞启动自然的DNA修复过程，断口处可能产生碱基错配，从而使目标基因产生突变或缺失等。Cas9蛋白与sgRNA 所形成的复合物的功能与基因操作工具中的功能类似，但长期存在于细胞核中的Cas9蛋白也可能产生对非目标DNA的切割，从而造成脱靶。
3. （2）热纤梭菌中 Co 和 Do蛋白能以高亲和力相互作用，形成复合物。科研人员将 Cas9蛋白的 N 端和 C 端两个片段分别与 Co 和 Do 蛋白融合，构建 Cas9(N) -Co 复合物和 Cas9(C)-Do复合物，这两个复合物在细胞中相遇时，Cas9可恢复全酶活性。
  科研人员构建图1所示的表达载体，导入受体细胞。
  启动子1为远红光诱导型启动子，启动子2 为持续表达启动子。据此分析，在没有远红光照射时，受体细胞中 Cas9(N)、Cas9(C) 和 Cas9蛋白的存在状态及位置是。与持续表达 Cas9全酶相比，上述方法的优势是。
5. （3）为检测上述基因编辑系统治疗肿瘤的效果，科研人员在小鼠皮下移植肿瘤制作荷瘤小鼠。将构建好的上述载体注射到荷瘤小鼠的肿瘤部位，实验组一段时间内定期用远红光照射荷瘤小鼠。
  ①检测本系统对目标基因PLK(一种肿瘤标志基因，可促进细胞分裂) 的编辑效果。实验过程如下：提取不同组别小鼠肿瘤细胞的DNA， PCR 扩增PLK 基因片段，所得PCR产物热变性后降温复性。用T酶(可识别含错配碱基的 DNA并在错配处切割)酶切复性后的PCR产物，电泳检测结果如图2所示。
  据图2 核酸电泳分离的 DNA分子大小可知此系统对目标基因进行了编辑，理由是。
  ②实验组小鼠的肿瘤明显小于对照组，分析原因是。
7. （4）科研人员希望利用本编辑系统对多个基因在不同时间进行可控编辑，思路是。
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1. (2024·义乌模拟) 在现代生物学中，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一项必不可少的技术，它可以复制出大量的DNA片段，为基因工程和分子诊断等提供了有力的技术支撑。

（1）已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是（填“细胞内”和“细胞外”）。
（2）同源切割是一种代替将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A，B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物对目的基因进行PCR。PCR反应体系中需加入模板、、、引物、Mg²⁺、缓冲液等。
（3）已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在的培养基上筛选培养。
（ii）由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。切去UGA基因的酵母菌应在的培养基上筛选培养。

（4）家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义，科研人员利用PCR技术扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1)，进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。请完成下表相关内容。

实验目的	方法步骤要点
囊胚样品DNA提取	选取细胞提取DNA
PCR引物的设计和合成	根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成引物
PCR扩增	预变性→变性→退火→延伸
鉴定分析
	对受体奶牛注射孕激素（或前列腺素）
胚胎移植	将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内

（5） PCR过程中反应温度最低的一步是，该步骤温度设置与引物的、、相关。

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1. (2024·安徽模拟) 萝卜是百姓喜爱的一种蔬菜，筛选优良性状，开展种质创新，对落实国家“种业振兴行动”计划，丰富“菜篮子工程”有重大应用价值。
1. （1）采用常规杂交育种，可培育出不同根形的品种。萝卜的根形由A、a和R、r两对等位基因控制，且独立遗传。现将两种稳定遗传的圆形萝卜进行杂交，F₁全为扁形；F₁自交，F₂有扁形、圆形和长形三种表型，比例为9：6：1。由题意可知，F₂中，长形萝卜的基因型为，扁形萝卜中杂合子比例为。
3. （2）利用返回式航天器搭载萝卜种子可使细胞产生基因突变。假设突变发生在某基因的内部，若编码区缺失一个核苷酸，则会引起编码的肽链改变；若突变是一个核苷酸的替换，但没有引起编码的蛋白质功能改变，其原因可能是（答出2点即可）。
5. （3）萝卜硫素具有抗炎、抗癌等生理功能，由黑芥子酶（Myr）水解前体物质形成。研究人员提取总RNA、逆转录形成cDNA，然后设计Myr基因特异引物，采用PCR方法扩增目的基因，经凝胶电泳后，发现有多条扩增带（其中也包含目的基因片段）。在不改变引物、PCR扩增体系和模板量的情况下、可采用的方法，特异扩增目的片段。研究人员对扩增出的DNA片段进行了序列测定，序列信息见下图，推测其最多可以编码个氨基酸的多肽（终止密码子为UAA/UAG/UGA）。在多肽合成过程中，tRNA“搬运”氨基酸到核糖体上，氨基酸结合部位在tRNA的端。
7. （4）研究人员希望采用Ti质粒上的T-DNA转移Myr基因，以便获得萝卜新品种。图中A、B、C、D、E为5种限制酶及其酶切位点，选用（填字母）进行酶切，以使插入T-DNA中的目的基因正确表达；将转入目的基因的体细胞培养形成，分化成植株，用于生产。
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Mg²⁺浓度/（mmol·L^-1）	0	2	3	4	5	6
Ipp20基因相对含量	-	+	++	+++++	++++	+++