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1. (2024高三下·贵阳模拟) CRM1 是一种核转运蛋白，由 CRMI 基因控制产生，转运含有 NES序列的货物蛋白。科学研究发现，肿瘤细胞中CRMI 基因过度表达，含有 NES序列的肿瘤抑制因子被过量地转运至细胞质，使得它们无法在细胞核内发挥正常功能，会促进肿瘤的发生及生长。为探究CRM1的运输机制及肿瘤的治疗，科学家进行了相关研究。请回答下列问题：
1. （1）研究人员利用 PCR 技术大量扩增CRMI 基因，需要根据设计两种引物，引物的作用是。
3. （2） CRM1 C528S 是 CRM1 突变体，不具有运输能力，GST-NES 为某种肿瘤抑制因子，CRM1蛋白可能与货物蛋白的转运有关，研究人员利用上述物质设计实验进行跨膜模拟，结果发现只有③组实现了对 GST-NES 的跨膜转运，据此可推断。
  
  ①
  ②
  ③
  ④
  GST-NES
  +
  +
  +
  +
  CRM1
  -
  +
  +
  -
  RanGTP
  -
  -
  +
  +
  CRM1 C528S
  -
  -
  -
  +
  注：“+”表示有；“-”表示无。
5. （3）科学家利用计算机成功筛选出了与货物蛋白结构相似的小分子 KPT，并将其制备成抑制肿瘤细胞药物，推测KPT的作用机理是。
  请设计实验验证上述推论，写出实验思路和预期结果。（材料：肿瘤小鼠模型若干只、正常小鼠模型若干只、小分子 KPT。注：药物处理方法与肿瘤的具体检测方法不做要求）
  实验思路：。
  预期结果：。
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1. (2024高三下·河池模拟) 目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法不正确的是（　　）

A . PCR退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链 B . 电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关 C . 选取引物甲丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接 D . 选取引物甲乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接

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1. (2024高三下·广西壮族自治区模拟) 近年来，卒中、脑梗、心梗等心脑血管病患病率持续上升。2023年11月国家卫健委发布《心脑血管疾病防治行动实施方案》推进对患者的救治和防病工作。
1. （1）卒中、脑梗、心梗等心脑血管病多是因动脉粥样硬化、血栓引起组织缺血所致。血栓由纤维蛋白构成，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）由527个氨基酸构成（如下图）， t-PA 进入血浆后激活纤溶酶原，使之转化成纤溶酶，酶将沉积在血管内壁的纤维蛋白分解血栓裂解，血管畅通。t-PA进入血浆后多与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，很快失去活性，所以溶栓时要持续输入t-PA。然而，大剂量t-PA易诱发出血。鉴于此，有人提出通过抑制的活性，以延长t-PA的活性。进一步研究显示，t-PA第84位的半胱氨酸替换为丝氨酸后的t-PA溶血栓更快，这种改造的t-PA副作用更小。用生物化学手段直接改造“t-PA”蛋白质的结构，或是定点改造 t-PA 基因成为“突变基因”，通过基因工程等生物工程技术获取“突变的t-PA”。通过后者改造“t-PA”的主要优势是（写出一点）。
3. （2）已知t-PA基因碱基序列、丝氨酸密码子，可以通过人工合成目的基因（t-PA 突变基因）、基因与质粒重组构建表达载体、表达载体进入受体细胞等一系列操作，最终获取“突变的t-PA”。这种基于t-PA的分子结构和功能的关系，通过一系列DNA 分子层面的操作获取人类所需蛋白产品的第二代基因工程过程又叫做。
5. （3）从上述人t-PA 基因获得第84位半胱氨酸替换为丝氨酸编码序列的t-PA突变基因，常借助PCR体外定点定向诱变获得。工作原理如图：先合成包含突变碱基的两个突变引物。因突变点不位于基因端点，要借助 PCR 获得完整的t-PA 突变基因，还要合成两个正常引物1、2.参考图中正常引物1（5'-TACCAAGTGATCTGCAGA-3'）、t-PA 基因和 PCR 诱变过程原理图，正常引物2 是5’……-3’（写出5’端的6个碱基即可）
7. （4）为了与质粒高效连接，t-PA突变基因两端应携带相应的限制酶识别序列。应将限制酶识别序列设计在两条正常引物的端。限制酶能够使 DNA 分子中特定部位的键断开。
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1. (2024高三下·关岭模拟) 科研人员构建了可表达GM-CSF（一种细胞因子）的重组质粒，以增加白细胞数量，通过基因工程技术大量生产GM-CSF，满足临床需求。M-CSF基因及相关限制酶的酶切位点如图所示。请回答下列问题。
1. （1）利用PCR技术扩增CM-CSF基因时，需要在引物上添加限制酶的识别序列，同时也便于与质粒正确连接。
3. （2）质粒和GM-CSF基因结合形成的重组质粒在受体细胞中能够稳定存在并发挥作用，在CM-CSF基因的首端必须具有，其作用是。
5. （3）筛选已导入GM-CSF基因的大肠杆菌时，先将大肠杆菌接种到含有抗生素的培养基中培养，从获得的菌落中取菌体接种到含有抗生素的培养基中，若（填“有菌落生长”或“无菌落生长”），则获得的培养物符合要求。
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1. (2024·贵州模拟) 在植物基因工程中外源基因表达量不足是目前利用转基因植物生产植物疫苗时存在的问题之一。研究表明，启动子的串联能增强外源基因的表达，研究人员拟构建含有两个35s启动子（35s启动子是花椰菜花叶病毒的一种强启动子）串联的转基因苜蓿。一个35s启动子包括1个A区和2个B区。图甲表示35s启动子及其附近区域分布的限制酶识别位点，已知不同限制酶切割后得到的黏性末端各不相同。图乙表示待转入第二个35s启动子的重组质粒的构成组件及其上的限制酶识别位点。
1. （1）利用PCR技术可以扩增35s启动子，PCR技术的原理是，此技术设计引物很关键，引物是。利用此技术扩增的35s启动子可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用来鉴定PCR的产物。
3. （2）根据限制酶识别位点，为了让第二个35s启动子准确串联在待转入的重组质粒上，应选择限制酶切割图甲的DNA片段。
5. （3）为了筛选出正确串联了两个35s启动子的新重组质粒菌落，研究人员用含有不同抗生素的平板进行筛选，平板类型丙和丁加入的抗生素分别是、，得到①②③三类菌落，其生长状况如下表（+代表生长，-表示不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是（填“①”“②”或“③”）类。若新获得的转基因苜蓿中目的基因的表达量大幅增加，可以说明串联两个35s启动子能。
  平板类型
  ①
  ②
  ③
  甲：无抗生素
  +
  +
  +
  乙：卡那霉素
  -
  -
  +
  丙：？
  -
  +
  +
  丁：？
  -
  -
  +
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1. (2024高三下·广州模拟) 中国科学家在广西获得了一块距今2.4万年的古大熊猫化石。将该化石中提取到的线粒体DNA 通过测序分析和比较，发现古大熊猫与现存大熊猫的相关 DNA 序列高度相似，且大熊猫与熊类有共同的远古祖先。下列叙述，不合理的是（　　）

A . 化石证据结合分子生物学分析，可为大熊猫进化提供更可靠的证据 B . 化石中提取的线粒体DNA 通过PCR 进行扩增，作为测序的材料 C . 该研究对获得大熊猫和熊类远古父系祖先的相关信息有直接帮助 D . 造成现存大熊猫与古大熊猫基因差异根本原因是发生了突变

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1. (2024高三·广东模拟) 某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图是科研人员利用该病毒S蛋白基因和RBD蛋白基因，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。
1. （1） PCR扩增时，需在催化下，在两种引物的端进行DNA链的延伸，获得扩增产物。
3. （2）为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5^'端添加的限制酶序列是。
5. （3）将重组pX质粒导入工程菌前，需用钙离子处理工程菌，使其处于一种的生理状态，便于重组质粒的导入。
7. （4）在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即先将工程菌接种到培养基A上，待长出菌落后使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），则培养基A上应添加的抗生素为（填“青霉素”或“四环素”）。若培养基B中有存活的菌落，则这些菌落的细胞内（填“含”或“不含”）S-RBD基因。鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是。
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1. (2024高三上·徐州期末) 利用新冠病毒（SARS-CoV-2）包膜表面的S蛋白研发的疫苗已在我国广泛接种。下图表示制备疫苗的相关过程，其中m、n分别是启动子和终止子，箭头处是限制酶的切点，SUC2是酵母菌的蔗糖转化酶基因，其终产物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成单糖被细胞利用。下表是可供选择使用的限制酶及其识别序列和切割位点。
限制酶
BamHI
NheI
NcoI
SphI
Sau3AI
识别序列和切割位点
5'-G↓CTAGC-3'
5'-G↓GATCC-3'
5'-C↓CATGG-3'
5'-GCATG↓C-3'
5'-↓GATC-3'
1. （1）上图②过程所使用的两种酶是，选择两种酶切割的优点是。
3. （2）由上图推测，目的基因S表达的模板链是a链，理由是；该目的基因的表达离不开m，原因是。
5. （3） RT-PCR是将RNA逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。利用S蛋白的RNA作为模板进行过程①，首先需要加入缓冲液、原料、酶I、引物I等物质后进行RT，获得单链DNA后，还需要添加与单链DNA互补的引物II及酶II，在PCR过程中酶I所处的状态是。以一个单链DNA为起点，进行n次循环的扩增，理论上需要个引物Ⅱ；PCR每次循环一般可以分为变性、、延伸三步。
7. （4） SUC2作为B上的标记基因，可以对导入B的酵母菌进行筛选。筛选时，需要使用以蔗糖为唯一碳源的培养基，对受体突变型酵母菌的要求是。
9. （5）与普通灭活或减活疫苗相比，上述方法制备的疫苗对人体更安全，主要原因是。
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1. (2023高三上·长沙期末) 拟南芥体内的基因X具有多个启动子，通过一种光敏色素作为受体，对光刺激进行应答，由此选择不同的启动子并转录出长度不同的mRNA，从而表达出存在于细胞内不同位置的不同蛋白质，由此使拟南芥呈现出不同的生长状态。其相关蛋白的合成过程如下图所示。
1. （1）两种蛋白质( 填“a”或 “b”) 末端的氨基酸序列相同，该末端对应的是蛋白质的(填“ -NH₂ ” 或“-COOH”)末端。a末端是引导蛋白质被运输进入叶绿体的信号肽段。
3. （2）研究人员通过特定技术，将绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因片段插入到基因X的特定位置，使表达出的蛋白质X①、X②能带有绿色荧光蛋白，以实现它们在细胞内的可视化，由此得到A系植株 (GFP基因不含启动子和终止子)。
  ① 根据图1，GFP基因片段应插入到基因X内字母表示的特定位置。
  ②GFP基因来自于水母等动物的细胞中，需先选择合适的限制酶将其从染色体DNA上切割下来。GFP基因两侧的碱基序列如图2所示，根据碱基序列应选择下表中的进行切割。
  限制酶
  识别序列
  BamHI
  G↓GATCC
  CCTAG↑G
  HindIII
  A↓AGCTT
  TTCGA↑A
  Notl
  G↓CGGCCGC CGCCGGC↑G
  EcoRI
  G↓AATTC
  CTTAA↑G
  ③酶切前需对GFP基因进行PCR扩增，b侧所用引物已经确定， a侧引物需在以下4种中进行选择。根据a侧序列应选择不选其他3种的理由是。在PCR仪中完成4个循环后，含有该引物的DNA片段数为个。
  引物1：5'ATCCTGCTA3’
  引物2：5'TATGGATCC3’
  引物3：5GGATCCATA3’
  引物4：5GGAAGGATA3’
5. （3）研究人员在A系植株的基础上，去除产生光敏色素的基因后得到B系植株。随后，分别在黑暗条件和红光条件下培养A 、B两系植株，培养条件及观测到荧光的部位如下表所示。
  表1 GFP荧光的局部部位
  发育条件
  黑暗条件
  红光条件
  A系植物
  细胞质基质
  叶绿体
  B系植物
  细胞质基质
  细胞质基质
  根据以上研究结果， A系植株对红光刺激作出应答被激活的原因是
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1. (2023高三上·常州期末) 下图1是QuickChange定点突变技术及副反应的示意图，其中的F和R代表引物，其上含有突变的碱基序列。请回答下列问题。
1. （1）图中PCR反应体系进行时，除需要加入引物F和引物R、原始质粒、缓冲液外，还需加入的物质有。
3. （2）已知DpnI酶是一种限制酶，能特异性识别腺嘌呤甲基化的GATC序列。由图可知，在原始质粒上有（选填“0”“1”或“很多”）个DpnI酶的切割位点。为成功获得带缺刻突变质粒，应对来自大肠杆菌的原始质粒进行的处理是。
5. （3）图中的DH5a细胞是处于的大肠杆菌，对带缺刻突变质粒进行修复时需要添加酶。图中副反应发生的原因是新链退火时，两条新链互补配对，互为复制的，扩增出非目的片段。该技术除了图示副反应外，还存在的不足是。
7. （4）研究人员对QuickChange定点突变技术进行了改进，在两个PCR体系中分别加入单引物F或R，具体过程下图2。
  ①单引物PCR1过程中，假设原始质粒有n个，每循环一次产生个双链DNA，循环30次需要个引物F。
  ②与QuickChange定点突变技术相比，单引物PCR除了能解决第（3）问中的不足，还存在的优点是
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丁：？	-	-	+

限制酶	BamHI	NheI	NcoI	SphI	Sau3AI
识别序列和切割位点	5'-G↓CTAGC-3'	5'-G↓GATCC-3'	5'-C↓CATGG-3'	5'-GCATG↓C-3'	5'-↓GATC-3'

	发育条件
	黑暗条件	红光条件
A系植物	细胞质基质	叶绿体
B系植物	细胞质基质	细胞质基质

	①	②	③	④
GST-NES	+	+	+	+
CRM1	-	+	+	-
RanGTP	-	-	+	+
CRM1 C528S	-	-	-	+